Introducción

A medida que las nanopartículas lipídicas han ido evolucionando, el número de aplicaciones potenciales ha crecido hasta incluir no sólo los fármacos de moléculas pequeñas y la administración de vacunas, sino también las terapias genéticas y otras. Pero, ¿qué nos depara el futuro?

La pandemia de COVID-19 hizo que las nanopartículas lipídicas (LNP) pasaran a primer plano, generando un gran interés a medida que el sector farmacéutico aprovechaba sus ventajas para la administración de vacunas de ARNm. Pero llevan mucho más tiempo en el mercado. Las LNP se basan en una tecnología de liposomas bien establecida, desarrollada después de que el científico británico Alec D Bangham descubriera los liposomas en la década de 1960. Las LNP se forman añadiendo lípidos ionizables o catiónicos a los liposomas para permitir la encapsulación de oligonucleótidos cargados negativamente -como el ARN y el ADN- mediante interacciones electrostáticas. La cubierta lipídica sirve entonces para proteger el material genético encapsulado contra la degradación prematura “in vivo” hasta que llega a las células objetivo.

Tras 30 años de esfuerzos, la FDA aprobó finalmente el primer fármaco liposomal -Doxil®- en 1995. Unos años más tarde, la conjugación de anticuerpos en la superficie se convirtió en un área popular de la investigación con liposomas, ya que las grandes biomoléculas eran capaces de unirse a receptores específicos en las células cancerosas. Sin embargo, los sistemas de administración de liposomas dirigidos a anticuerpos no lograron mejorar el efecto terapéutico en comparación con el Doxil en los ensayos clínicos. Más recientemente, el primer producto genético liposomal para la entrega de siRNA, Onpattro®, fue aprobado en 2018, lo que hace posible tratar la enfermedad hepática mediante la administración intravenosa de LNPs que llevan material genético terapéutico.

Los liposomas y las LNP tienen muchas ventajas probadas como sistemas de administración de fármacos, ya que reducen en gran medida la probabilidad de cardiotoxicidad asociada al fármaco -un beneficio clave por el que es conocido Doxil- y ofrecen la capacidad de dirigirse preferentemente al tejido de interés. Ya hemos hablado de su éxito sin precedentes en la administración de vacunas; es de sobra conocido que varias vacunas contra el COVID-19 -como las de Moderna y Pfizer-BioNTech- utilizan las PRL para introducir el ARNm en las células, donde se libera para producir proteínas que ayudan a contrarrestar el virus del SARS-CoV-2.

Sin embargo, una de las áreas más interesantes para el futuro de las PRL es la terapia génética, donde están demostrando su valor como vectores de entrega no virales. Los vectores virales tradicionales tienen una capacidad limitada de administración de genes, normalmente inferior a 10 kilobases (10.000 pares de bases) y requieren un complicado proceso de ingeniería y fabricación. Además, suelen estimular una respuesta inmunitaria no deseada en el organismo -por ejemplo, inflamación y fallo de órganos- y tienen el potencial de provocar mutaciones al insertar sus propios genes en el genoma de las células objetivo. Los vectores no virales, como las LNPs, han surgido como una forma de superar todos estos problemas, eliminando la limitación del tamaño del gen que se puede entregar y reduciendo el riesgo de efectos adversos.

A medida que aumenta el trabajo con las LNPs en toda la industria, hay dos áreas que merecen una atención especial: los procesos de producción y los métodos de administración de fármacos.

ARNm: la terapia genética transitoria

Las actuales terapias basadas en el ARN que se comercializan controlan principalmente los síntomas de las enfermedades, en lugar de curarlas de forma permanente. Sin embargo, en los últimos años también se han producido grandes avances en el desarrollo de terapias genéticas permanentes. Por ejemplo, CRISPR cas-9 es capaz de eliminar con precisión un gen específico “in vivo” para el tratamiento de enfermedades hepáticas cuando se inyecta por vía intravenosa. Basándose en este éxito, los científicos van ahora un paso más allá, investigando el potencial de realizar inserciones permanentes para sustituir secuencias genéticas perjudiciales.

Al mismo tiempo, las terapias genéticas transitorias también están ganando adeptos, sobre todo porque las inserciones y supresiones permanentes de ADN requieren una edición de genes extremadamente precisa, lo que hace que sean difíciles de llevar a cabo de forma fiable, y por lo tanto conllevan riesgos significativos. Las terapias basadas en ARNm son un ejemplo de este enfoque, ya que conducen a la expresión de proteínas durante sólo unos días, después de lo cual el ARNm se elimina del cuerpo. Esto alivia la preocupación por la acumulación en el tejido o los efectos secundarios graves a largo plazo.

Varias empresas biofarmacéuticas, como BioNTech, están produciendo ahora terapias combinadas que administran antígenos cancerígenos mediante una vacuna de ARNm LNP. Los antígenos activan el propio sistema inmunitario del organismo, estimulándolo para que produzca anticuerpos y células B y T específicas contra las células cancerosas. Esto hace que el cuerpo reconozca y ataque al propio tumor junto con los inhibidores del punto de control, además de prepararlo mejor para reconocer futuras mutaciones cancerosas, minimizando la posibilidad de que el cáncer reaparezca. Sin embargo, los tumores cancerosos también tienen su propio sistema de defensa que les permite evitar el ataque del sistema inmunitario, y también induce la muerte de las células T. Por lo tanto, para maximizar el efecto terapéutico, es necesario administrar tratamientos adicionales para debilitar dicho sistema de defensa del tumor, en combinación con la vacuna de ARNm. Estas terapias combinadas podrían incluir un inhibidor del punto de control, o incluso células T modificadas genéticamente, como las células CAR-T, que son capaces de eliminar directamente las células cancerosas.

El problema de la producción

Las LNP se forman mediante un proceso de autoensamblaje que es muy difícil de controlar y ampliar, lo que supone unos costes financieros considerables que pueden resultar inviables para muchas empresas de biotecnología. Por ello, se han dedicado muchos esfuerzos a mejorar la formación del complejo LNP-ARNm mediante una mezcla más precisa de lípidos y ARNm para aumentar la consistencia del proceso. Un ejemplo de ello es un método de inyección de etanol ampliamente aplicado, en el que se utiliza una jeringa para inyectar lípidos suspendidos en etanol gota a gota en soluciones acuosas de ARNm. La mezcla en T es otra opción común, y se utiliza sobre todo en la síntesis de LNP a gran escala.

Sin embargo, ninguno de estos métodos de producción por lotes puede generar nanopartículas de LNP-ARNm verdaderamente monodispersas, y pueden carecer de consistencia entre lotes en términos de tamaño de partícula, composición y morfología. Además, las fuerzas de cizallamiento aplicadas a las partículas por estas técnicas podrían acelerar la degradación y romper las nanopartículas de LNP-ARNm. El resultado es que la mayoría de los tratamientos con LNP-ARNm son innecesariamente costosos y de baja eficacia terapéutica. De hecho, numerosos estudios han demostrado que menos del cuatro por ciento de las nanopartículas de LNP-ARNm son capaces de liberar eficazmente ARNm intracelularmente en cultivo celular, y se cree que esta cifra es aún menor cuando se administran en el músculo (1,2).

Los dispositivos microfluídicos podrían proporcionar ventajas en comparación con la inyección de etanol y la mezcla de T, ya que mantienen condiciones consistentes para el autoensamblaje de las PNL y ofrecen un mayor control del proceso. Este enfoque facilita la determinación de la formulación que mejor funciona tanto para maximizar los efectos terapéuticos como para minimizar los efectos secundarios. A diferencia de los métodos de producción tradicionales, los sistemas microfluídicos se basan en que los fluidos fluyen hacia un chip microfluídico desde canales separados, se juntan en la unión y se mezclan activamente de forma reproducible para formar nanopartículas. El diseño del chip permite una mezcla precisa de los fluidos hasta volúmenes de un solo microlitro, y un funcionamiento continuo, en lugar de una producción por lotes. Además, una configuración microfluídica optimizada genera nanopartículas de LNP-ARNm altamente monodispersas, con una mayor homogeneidad en la población en términos de composición lipídica, carga de ARNm y morfología (3). Estas partículas también muestran una mayor eficiencia de carga de ARNm, lo que tiene el doble beneficio de reducir el desperdicio de materiales costosos, y potencialmente permitir dosis significativamente reducidas.

Además, los flujos de trabajo en microfluídica se adaptan bien a la automatización y a la fabricación de alto rendimiento, lo que permite producir más vacunas o fármacos terapéuticos en un corto espacio de tiempo, por ejemplo, cuando se está bajo presión de tiempo durante una pandemia. Las metodologías automatizadas de alto rendimiento suelen ser más rentables que las técnicas por lotes, que suelen requerir más tiempo y trabajo.

Desarrollos en curso en materia de administración

Las LNP que contienen material genético terapéutico u otros API pueden administrarse en el tejido objetivo de forma sistémica o tópica. La administración sistémica se realiza normalmente por vía intravenosa, como en el tratamiento de enfermedades hepáticas. Una vez que las LNP llegan al órgano de interés, deben penetrar en el tejido y ser absorbidas por el tipo de célula objetivo, por ejemplo, mediante endocitosis mediada por receptores. A continuación, la LNP se desintegra, el fármaco se libera y, tras el escape endosómico, comienza a actuar en las vías diana. En la actualidad, el mecanismo de escape endosomal aún no se conoce del todo, y se cree que su eficacia es muy baja. La corona proteica de las partículas puede tener una gran influencia en la actuación y la capacidad de dirigirse al tejido de interés, pero los mecanismos subyacentes de esto aún se están investigando. Estas grandes incógnitas han desencadenado una gran cantidad de investigaciones sobre cómo diseñar las LNP para obtener un rendimiento óptimo, asegurando un escape endosomal eficiente y una acumulación preferente en el tipo de célula objetivo. También se ha prestado recientemente atención a los mecanismos de administración basados en las LNP que son capaces de atravesar la barrera hematoencefálica.

La administración también puede ser localizada, realizándose por vía intramuscular, transdérmica o por inhalación utilizando PNLs que han sido aerosolizadas en un nebulizador. La inhalación es actualmente una de las vías de administración más utilizadas, con varios ensayos clínicos en curso. Este método lleva las terapias directamente a los pulmones y puede utilizarse para tratar enfermedades graves como la fibrosis quística, lo que la convierte en una técnica de administración especialmente prometedora. Sin embargo, el mayor reto de la administración por inhalación es que la malla vibratoria utilizada en un nebulizador para la formación de aerosoles puede dañar la estructura de la PNL, causando la degradación temprana del ARN y la pérdida de la función biológica antes de llegar a las células de interés. Por lo tanto, existe una necesidad constante de un nebulizador especialmente diseñado capaz de crear aerosoles de las LNP sin causar daños.

Ejemplo Práctico de creación de LNP usando Microfluídica

La plataforma automática de creación de nanopartículas de Particle Works (ANP) utiliza la microfluídica para controlar el tamaño de las LNP creadas de forma automática, a partir de 20 nm, lo que permite una amplia gama de aplicaciones para el usuario final. Entre las principales características del sistema automatizado de nanopartículas se incluyen la ejecución de protocolos con tablas de experimentos importables para generar bibliotecas de formulaciones, una vez optimizada la síntesis el equipo permite trabajar en modo continuo aumentando la capacidad de producción, por ejemplo para lotes de ensayos clínicos o pequeña producción.

En el siguiente experimento se investigaron los parámetros que permiten ajustar el tamaño de las LNPs, como la relación entre las ratios de los flujos (FRR) entre la fase orgánica y la acuosa, y el flujo total (TFR). Además, se realizó una comparación entre el modo protocolo y el modo continuo para demostrar la transferibilidad de los parámetros del proceso para la producción a granel de LNPs.

La FRR se investigó cambiando la fase orgánica en relación con la fase acuosa. Los datos muestran que cambiando la relación de flujos, FRR se puede cambiar el tamaño de las LNP de forma consistente y reproducible (Figura 2). Se alcanzó una PDI de 0,06 para una FRR de 3:1:1, mientras que en general la PDI fue < 0,2 durante el ensayo y la optimización de los parámetros. Se pudo conseguir una PDI minimizada repetible para los experimentos.

También se investigó el TFR para observar su influencia en el tamaño de la LNP; los datos de la formulación investigada no mostraron cambios significativos en el tamaño de la LNP al aumentar el TFR (figuras 3 y 4). A mayor TFR (>10 ml/min) se observó una disminución de 10 nm (figura 3).

Para examinar más a fondo la robustez del sistema, la misma formulación se ejecutó a continuación en modo continuo. Los resultados entre el protocolo y el modo continuo son comparables, lo que demuestra que, una vez optimizada una formulación, puede producirse a granel de forma fiable en modo continuo a varios TFR (Figuras 5 y 6).

Figura 3. Nanopartículas lipídicas Nanopartículas lipídicas producidas variando el caudal total (TFR) a una relación de caudal FRR fija de 2:1:1 (orgánico: acuoso: dilución). Las LNP oscilaban entre 66 nm y 78 nm, con una PDI media de 0,17 y una desviación estándar de 0,01. La distribución media (n=3) del tamaño de partícula y el índice de polidispersidad (PDI) se determinaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) de Malvern. Las barras de error representan la desviación estándar de la media.

Figura 4. Nanopartículas lipídicas Nanopartículas lipídicas producidas variando el caudal total (TFR) a una relación de caudal fija de 1,5:1:1 (orgánico; acuoso: dilución). Las LNP oscilaban entre 57 nm y 66 nm, con una PDI media de 0,19 y una desviación estándar de 0,01. La distribución media (n=3) del tamaño de partícula y el índice de polidispersidad (PDI) se determinaron mediante dispersión dinámica de luz Malvern.

Figura 5. Nanopartículas lipídicas producidas de forma continua a un caudal total (TFR) de 3 ml/min a distintas relaciones de caudal (FRR). Las LNP oscilaron entre 19 nm y 57 nm, la PDI se mantuvo constante entre series oscilando entre 0,15 y 0,2 con una desviación estándar de 0,01. La distribución media (n=3) del tamaño de partícula y el índice de polidispersidad (PDI) se determinaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) de Malvern. Las barras de error representan la desviación estándar de la media.

Figura 6. Nanopartículas lipídicas producidas de forma continua a un caudal total (TFR) de 10 ml/min variando la relación de caudal (FRR). Las LNP oscilan entre 15 nm y 55 nm, la PDI se mantuvo constante entre series oscilando entre 0,15 y 0,2 con una desviación estándar de 0,01. La distribución media (n=3) del tamaño de partícula y el índice de polidispersidad (PDI) se determinaron mediante dispersión dinámica de luz (DLS) de Malvern. Las barras de error representan la desviación estándar de la media.

La homogeneidad y el tamaño de las LNP desempeñan un papel clave en la determinación de la eficacia del API encapsulado. Por lo tanto, es vital que las LNP no sólo sean controlables, sino también reproducibles. La formulación lipídica ensayada en esta nota de aplicación demostró que el tamaño de las LNP, así como la PDI, pueden controlarse fácilmente manipulando la FRR entre la fase orgánica y la acuosa (Figura 2). La focalización hidrodinámica del flujo mezcla las dos fases basándose totalmente en la difusión molecular en la dirección de las corrientes de flujo del fluido, lo que se denomina mezcla de flujo laminar. El sistema ANP puede utilizarse con una serie de tipos de chips; la mezcla también puede lograrse utilizando nuestros chips micromezcladores para permitir la mezcla por advección caótica.

A medida que aumenta la proporción entre la fase orgánica y la acuosa, también aumenta el tamaño de la LNP. El aumento de tamaño se debe a las mayores concentraciones locales de lípidos durante el crecimiento del liposoma, lo que significa que hay más lípidos disponibles para integrarse en la estructura de la partícula. Además, como el cambio en la solubilidad del lípido es menor, se produce una nucleación menos agresiva de las partículas, lo que potencialmente significa que se forman menos partículas en total y, por tanto, cada una de ellas aumenta de tamaño dada la cantidad de material presente.

Del mismo modo, el TFR también es un factor importante que puede ayudar a reducir el tiempo total de generación de LNP. Los resultados del TFR (Figuras 4 y 5) demuestran que el tiempo de generación de LNP puede acortarse para aumentar el rendimiento. En este régimen, el TFR no es un factor limitante hasta >10 ml/min, momento en el que el TFR empieza a tener más efecto; normalmente los efectos FRR dominan a TFRs más bajos.

Para otras formulaciones y concentraciones de lípidos, la TFR puede influir en el tamaño de la LNP; esto puede ocurrir porque se acorta el tiempo necesario para la difusión entre la fase orgánica y la acuosa. Como resultado, la velocidad a la que los lípidos pueden autoensamblarse supera la velocidad de difusión, lo que da lugar a LNP más pequeñas.

Para examinar más a fondo la escalabilidad, se investigó el protocolo frente a la producción continua. Los resultados (Figuras 5 y 6) demostraron que el tamaño de las LNP no se veía afectado en gran medida por el TFR y la producción continua. Esto demuestra que el ensamblaje de LNP sigue siendo idéntico al modo de protocolo y que el usuario puede optar por la producción en masa tras la optimización de la generación de bibliotecas sin necesidad de un desarrollo adicional del proceso.

Los parámetros investigados aquí demuestran que es importante controlar la técnica de mezcla y la proporción para conseguir un tamaño de LNP deseado. En segundo lugar, la homogeneidad de la PNL medida por la PDI (tan baja como 0,06 para la formulación probada) es importante para todas las aplicaciones finales para mejorar la eficacia. La reproducibilidad es primordial en cualquier proceso de generación de LNP, y los resultados que aquí se presentan muestran una variación mínima entre cada repetición, ya que las condiciones del proceso automatizado fueron idénticas, produciendo LNP con una PDI baja de forma fiable. La automatización controlada por FCC de los parámetros del proceso y del hardware garantiza la minimización de los errores humanos o de los cambios en las condiciones de funcionamiento.

Queda mucho por aprender

La comunidad de investigadores de liposomas y PNL fue muy reducida durante muchos años, pero, como era de esperar, ha crecido exponencialmente desde la pandemia de COVID-19. Las LNP son claramente un campo de investigación apasionante, y están generando un gran interés en múltiples industrias gracias a su versatilidad. Las terapias de ARN, en particular, están provocando una rápida revolución en la medicina, y el campo de las terapias genéticas está en pleno auge. Prácticamente cualquier enfermedad que se quiera nombrar puede ser tratada con terapias genéticas basadas en el ARN, y ya se dispone de todas las tecnologías necesarias para permitir su administración a través de las PNL. Aunque se trata de un nicho muy desafiante, los nuevos medicamentos genómicos proporcionarían importantes beneficios clínicos para una serie de condiciones, y ofrecen soluciones buscadas que podrían abordar las necesidades clínicas actualmente insatisfechas. En resumen, nunca ha habido un mejor momento que ahora para trabajar en las LNP para la terapia genéticas. MTB España es distribuidor de Particle Works y Dolomite (inform@mtb.es).

Autor: Bowen Tian

Especialista en aplicaciones de Particle Works